Genetik Mühendisliği
Genetik mühendisliği, organizmalarda genleri değiştirmek için laboratuvarda teknikler kullanarak DNA'nın kasıtlı olarak manipüle edilmesidir. Değiştirilen organizmalar mikroplar olmasa bile, kullanılan maddeler ve teknikler genellikle mikroplardan alınır ve daha karmaşık organizmalarda kullanılmak üzere uyarlanır.
Bir Genin Klonlanmasındaki Adımlar
İlgilenilen bir genin birçok kez çoğaltılabildiği bir süreç olan bir genin klonlanması için temel adımları gözden geçirelim. E. coli hücrelerini, doğal olarak sahip olmadıkları bir özellik olan karanlıkta parlamaları için genetik olarak tasarlayacağımızı varsayalım.
- İlgilenilen DNA'yı izole edin - öncelikle ilgilendiğimiz genleri veya hedef DNA'yı tanımlamamız gerekir. E. coli hücrelerimizin karanlıkta parlamasını istiyorsak, bu özelliğe sahip bir organizma bulmamız ve özellikten sorumlu gen veya genleri tanımlamamız gerekir. Moleküler tekniklerde yaygın olarak bir ifade belirteci olarak kullanılan yeşil floresan protein (GFP) ilk olarak deniz anasından izole edilmiştir. Bir genin klonlanmasında, hedef DNA'yı bir konumdan diğerine istikrarlı bir şekilde taşıyacak bağımsız replikasyon yeteneğine sahip bir klonlama vektörünün, tipik olarak bir plazmid veya virüsün kullanılması yararlıdır. Plazmid vektörleri hem bakteri hem de mayadan elde edilebilir.
- DNA'nın restriksiyon endonükleazları ile kesilmesi - hedef ve vektör DNA tanımlandıktan sonra, her iki DNA türü de restriksiyon endonükleazları kullanılarak kesilir. Bu enzimler 4-8 bp uzunluğundaki kısa DNA dizilerini tanır. Bu enzimler hem bakterilerde hem de arkelerde yaygındır ve her bir enzim palindromik olan (her bir DNA ipliğinde 5' ila 3' yönünde aynı şeyi okuyan) belirli bir ters çevrilmiş tekrar dizisini tanır.
While some restriction endonucleases cut straight across the DNA (i.e. blunt cut), many make staggered cuts, producing a very short region of single-stranded DNA on each strand. Bu tek sarmallı bölgeler "yapışkan uçlar" olarak adlandırılır ve eşleşmemiş bazlar tamamlayıcı baz dizisine sahip herhangi bir DNA ile rekombine olacağından moleküler klonlamada çok değerlidir.
- Hedef ve vektör DNA'nın birleştirilmesi - her iki DNA türü de aynı restriksiyon endonükleaz tarafından parçalandıktan sonra, DNA'nın şeker-fosfat omurgası üzerindeki kovalent bağları onaran bir enzim olan DNA ligaz ilavesiyle iki DNA türü birleştirilir. Bunun sonucunda rekombinant DNA (yani iki veya daha fazla kaynaktan gelen DNA moleküllerini içeren, ayrıca kimeralar olarak da bilinen DNA molekülleri) oluşur.
- Rekombine molekülün konak hücreye sokulması - hedef DNA, vektör DNA ile kararlı bir şekilde birleştirildikten sonra, genlerin çoğaltılması veya ifade edilmesi için rekombinant DNA'nın bir konak hücreye sokulması gerekir. Rekombinant DNA'yı tanıtmak için, büyük ölçüde konak organizmanın karmaşıklığına bağlı olarak farklı yöntemler vardır. Bakteriler söz konusu olduğunda, rekombinant DNA moleküllerini almak için yetkin hücrelerin kullanıldığı transformasyon genellikle en kolay yöntemdir. Alternatif olarak, elektroporasyon kullanılabilir, burada hücreler kısa süreli yüksek gerilimli bir elektrik darbesine maruz bırakılır ve plazma zarı geçici olarak DNA geçişine geçirgen hale gelir. Bazı hücreler uygun konfigürasyona sahip rekombinant DNA (yani vektör DNA ile birleştirilmiş hedef DNA) elde ederken, yöntem aynı zamanda alternatif DNA kombinasyonlarına sahip rekombinant DNA taşıyan hücreler de (yani başka bir plazmid DNA molekülü ile birleşen plazmid DNA veya daha fazla hedef DNA'ya bağlı hedef DNA) verecektir. Karışım genomik kütüphane olarak adlandırılır ve uygun klonun seçilmesi için taranması gerekir. Başlangıçta rastgele DNA parçaları kullanılmışsa (uygun hedef DNA genlerinin izolasyonu yerine), bu süreç shotgun klonlama olarak adlandırılır ve taranacak binlerce veya on binlerce klon ortaya çıkarabilir.
Rekombinant DNA'nın Bakteri Dışındaki Hücrelere Tanıtılması
Agrobacterium Tumefaciens ve Ti Plazmidi
Agrobacterium tumefaciens, taç safra hastalığı adı verilen tümör oluşumuna neden olan bir bitki patojenidir. Bakteri, Ti (tümör indükleyici) plazmid olarak bilinen ve bakteriyel DNA'yı konakçı bitki genomuna yerleştiren bir plazmid içerir. Bilim insanları bu doğal süreci, Ti plazmidine yabancı DNA ekleyerek ve hastalık için gerekli genleri çıkararak bitkilerin genetik mühendisliğini yapmak için kullanır ve transgenik bitkilerin üretimine izin verir.
Gen Tabancası
Bir gen tabancası, rekombinant DNA ile kaplanmış çok küçük metal parçacıklar (mikroprojektiller) kullanır ve bunlar bitki veya hayvan dokusuna yüksek bir hızda püskürtülür. DNA dönüştürülürse veya hücrenin DNA'sı tarafından alınırsa, genler ifade edilir.
Viral Vektörler
Viral bir vektör için, bir virüsten virülans genleri çıkarılabilir ve yabancı DNA eklenebilir, böylece virüs kapsidinin genetik materyalin bir bitki veya hayvan hücresine taşınması için bir mekanizma olarak kullanılmasına izin verilir. İşaretleyici genler genleri alan hücrelerin belirlenmesine olanak sağlayacak şekilde tipik olarak eklenir.
CRISPR-Cas9 Genom Düzenleme
CRISPR, Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar anlamına gelmektedir (şimdi neden herkesin sadece CRISPR dediğini biliyorsunuz). Bakteriyel ve arkeal genomlarda yaygın olarak bulunan bir DNA dizileri ailesini ifade eder ve diziler orijinal olarak lizojenik bakteriyofajdan gelir. Hücreler bu DNA parçalarını Cas9 (CRISPR-associated protein 9) enzimi ile birlikte kullanarak benzer DNA'ları tespit edip yok etmekte ve böylece sonraki bakteriyofaj enfeksiyonlarını önlemektedir. Ancak bu doğal gen düzenleme süreci, ökaryotik organizmalarda da genomları doğrudan düzenlemek için, tipik olarak ya bir geni silerek ya da bir gen ekleyerek kullanılabilir.
DNA Teknikleri
Jel Elektroforezi
Jel elektroforezi, nükleik asit parçalarını boyutlarına göre ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Belirli parçaları tanımlamak veya bir tekniğin başarılı olduğunu doğrulamak için kullanılabilir.
Agarozdan yapılmış gözenekli bir jel hazırlanır ve konsantrasyon beklenen boyuta göre ayarlanır. Nükleik asit örnekleri jel içindeki kuyucuklara bırakılır ve bir elektrik akımı uygulanır. Nükleik asit, negatif yükü ile jelin altına yerleştirilmesi gereken pozitif elektroda doğru hareket edecektir. Nükleik asit jel boyunca hareket edecek, en küçük parçalar en az dirençle karşılaşacak ve böylece en hızlı şekilde ilerleyecektir. Her bir nükleik asit parçasının geçiş uzunluğu, bilinen büyüklükteki parçalara sahip bir DNA merdiveni ile karşılaştırılabilir.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA'yı in vitro olarak kopyalamak veya çoğaltmak için kullanılan bir yöntemdir. Bu süreç, kısa bir süre içinde tek bir genin milyarlarca kat kopyasını üretebilir. Şablon DNA, DNA kopyaları oluşturmak için gerekli tüm bileşenlerle karıştırılır: primerler (her iki tarafındaki dizileri tanıyarak ilgilenilen geni veya genleri çevreleyen küçük oligonükleotidler), nükleotidler (DNA'nın yapı taşları) ve DNA polimeraz. Adımlar, şablon DNA'yı denatüre etmek veya iplikçikleri ayırmak için ısıtmayı, primerlerin anneal olmasını sağlamak için sıcaklığı düşürmeyi ve ardından orijinal DNA'yı ilk şablon olarak kullanarak DNA polimerazın primerleri uzatmasına izin vermek için karışımı ısıtmayı içerir. Döngü 20-30 kez tekrarlanır ve birkaç saat içinde hedef DNA miktarı katlanarak artar.
Genetiği Değiştirilmiş Organizmaların Kullanım Alanları
Genetiği değiştirilmiş bir organizma (GDO) veya farklı bir organizmadan gen içeren genetiği değiştirilmiş bir organizma olarak tanımlanan transgenik bir organizma yaratmak için çok sayıda neden olabilir. Genellikle GDO'nun ihtiyaç duyulan bilgiyi ya da toplum için değerli bir ürünü sağlayacağı umulur.
DNA'nın Kaynağı
Genetiği değiştirilmiş organizmalar, bir DNA parçasının kolayca çoğaltılabileceği ve bu DNA'nın büyük bir kaynağını sağlayacak şekilde yapılabilir. Örneğin, meme kanseri ile ilişkili bir gen E. coli genomuna eklenebilir ve böylece insan gönüllülerden tekrarlanan doku bağışlarına gerek kalmadan genin hızlı bir şekilde üretilmesine, üzerinde çalışılmasına ve manipüle edilmesine olanak sağlanabilir.
RNA'nın Kaynağı
Antisens RNA, bir proteini kodlayacak olan mRNA'ya tamamlayıcı olan tek sarmallı RNA'dır. Hücrelerde hedef genleri kontrol etmenin bir yolu olarak yapılır. Belirli bir proteinin üretiminden kaynaklanan hastalıkları önlemenin bir yolu olarak antisens RNA kullanımına olan ilgi giderek artmaktadır.
Protein Kaynağı
Mikroplar çok hızlı çoğaldıkları için, onları ilgi çekici veya değerli proteinler üretmek için kullanmak son derece avantajlı olabilir. Doğru promotörler verildiğinde, bakteriler sitokin gibi bakterilerde doğal olarak bulunmayan proteinler için genleri ifade edecektir. Genetiği değiştirilmiş hücreler, insülin veya insan büyüme hormonu gibi insanların kullanımına yönelik çok çeşitli proteinlerin yapımında kullanılmıştır.
Yorumlar
Yorum Gönder