Mikroskoplar
Muhtemelen mikropların (diğer adıyla mikroorganizmaların) oldukça küçük olduğunu anlamışsınızdır, değil mi? Evet, ama boyut her şey demek değildir. Ama sayılar, bu da bir şeydir. Eğer bir gram toprak alıp, içindeki mikropları saniyede 1 mikrop hızında saymaya başlarsanız, sayımınızı tamamlamanız 33 yıldan fazla sürer. O zaman çoğunuz 50'li yaşlarda ve orta yaş krizi yaşıyor olurdunuz, o yüzden o konuya girmeyelim… ancak mikropların küçük boyutları, özellikle başlangıçta onları incelemeyi kesinlikle zorlaştırmıştır. (Ölçek hakkında görsel bir fikir edinmek istiyorsanız, bir kahve çekirdeğinden bir karbon atomuna kadar yakınlaştırma yapmanızı sağlayan Hücre Boyutu ve Ölçeği aracına göz atın. Aradaki mikroplara dikkat ettiğinizden emin olun!)
Pekala, gerçekten çok çok küçük bir şey görmek istiyorsanız, kimi arayacaksınız? Hayalet Avcıları değil, orası kesin. Ben olsam mikroskoplu birini denerdim. (Mikroskop Man? Belki de değil.) Şimdi itiraf edeceğim, moleküler biyolojinin ortaya çıkmasıyla birlikte, mikroskop olmadan yapılan birçok mikrobiyoloji çalışması mevcut. Ancak mikropları gerçekten görselleştirmek istiyorsanız, büyütme yeteneğine ihtiyacınız olacak - bir tür mikroskoba ihtiyacınız olacak. Ve "görmek inanmaktır" ilkesinden hareketle, insanların mikroplara ilgi duymasını sağlayan şey mikropların görselleştirilmesiydi.
1600'lü Yıllarda Mikroskopi
Robert Hooke'un 1665 yılında mikropları gerçekten gözlemleyen ilk bilim insanlarından biri olduğuna inanılmaktadır. Mikroskop altında incelediği çeşitli nesnelerden yaptığı illüstrasyonlar ve gözlemler Micrographia adlı kitapta yayımlandı. Hooke bir bileşik mikroskop kullandı, yani büyütme için iki mercek seti içeriyordu: gözün yanındaki oküler lens ve numunenin veya nesnenin yanındaki objektif lens. Bir bileşik mikroskobun büyütmesi, oküler lens büyütmesi ve objektif lens büyütmesinin bir ürünüdür. Böylece oküler büyütmesi 10x ve objektif büyütmesi 50x olan bir mikroskop toplam 500x büyütmeye sahip olacaktır. Aşağıdaki şekilde Hooke'un mikroskobunun bir çizimini görebilirsiniz:
Genellikle "Mikrobiyolojinin Babası" olarak adlandırılan Antonie van Leeuwenhoek, mesleği gereği bir bilim insanı değildi. Hooke'un çalışmalarından esinlendiğine inanılan Hollandalı bir kumaş tüccarıydı ve muhtemelen asıl niyeti kalitesini belirlemek için tekstil ürünlerini incelemekti. Van Leeuwenhoek çok hızlı bir şekilde hemen hemen her şeyi mikroskop altında incelemeye başladı ve bunu biliyoruz çünkü hem örnekleri hem de gözlemleri hakkında ayrıntılı notlar tuttu. Van Leeuwenhoek basit mikroskop olarak adlandırılan, sadece tek bir merceği olan bir mikroskop kullanıyordu. Esasen bir büyüteçtir. Ancak ürettiği mercekler o kadar yüksek kalitedeydi ki, tek hücreli yaşam formlarının keşfi için kendisine itibar edildi.
Modern Mikroskopi: Işık Mikroskopları
Kabul edelim ki, modern bir mikroskop, ucuz versiyonlarından biri bile olsa, oldukça teknik bir araçtır. Bir ışık mikroskobunun sınırlarını anlamak istiyorsanız, çözünürlük, dalga boyu ve sayısal açıklık gibi kavramları anlamanız gerekir; bunların birbirleriyle olan ilişkisi Abbé denklemiyle özetlenir:
Mikroskopide çözünürlüğün tanımı tipik olarak bir merceğin birbirine yakın iki nesneyi ayırt etme yeteneğidir. Dolayısıyla, Abbé denkleminde d, yan yana iki nesnenin çözülebildiği veya ayrı nesneler olarak ayırt edilebildiği minimum mesafe haline gelir. Çözünürlük, kullanılan aydınlatmanın dalga boyuna bağlıdır; daha kısa bir dalga boyu daha küçük bir d ile sonuçlanacaktır. Son olarak, hedef lensin ışığı toplama yeteneğine bağlı olarak hesaplanan sayısal apertürün etkisinden bahsediyoruz. Sayısal apertür değeri aslında iki bileşen tarafından tanımlanır: n, merceğin içinde çalıştığı ortamın kırılma indisi ve sin θ, objektife giren ışık konisinin bir ölçümüdür. Bir lens tipik olarak iki ortamda çalışabilir: kırılma indisi 1.00 olan hava veya kırılma indisi 1.25 olan yağ. Yağ, ışık ışınlarının daha fazlasını objektif merceğine yönlendirerek ışığın daha fazlasının toplanmasını sağlayacaktır. Görsel ışık kullanarak aydınlatma yapan bir mikroskop için maksimum toplam büyütme yaklaşık olarak 1500X'tir, burada mikroskopun 15x oküler ve 100x yağ batırma objektiflere sahip olabileceği düşünülür. Mümkün olan en yüksek çözünürlük yaklaşık 0,2 μm'dir. Nesneler veya hücreler birbirlerine bundan daha yakınsa, ayrı varlıklar olarak ayırt edilemezler.
Işık mikroskopları için, hepsi de aydınlatma kaynağı olarak ışığı kullanan altı farklı mikroskop türü vardır: aydınlık alan mikroskobu, karanlık alan mikroskobu, faz kontrast mikroskobu, diferansiyel girişim kontrastı (DIC), floresan mikroskobu ve konfokal taramalı lazer mikroskobu (CSLM). Şimdi her bir türün ayrıntılarına bakalım:
Aydınlık Alan Mikroskobu
Aydınlık alan mikroskobu, yeğeniniz için herhangi bir oyuncakçıdan satın alabileceğiniz standart mikroskoptur. Numune, mikroskobun tabanındaki bir ışık kaynağı tarafından aydınlatılır ve ardından oküler lens tarafından tekrar büyütülmeden önce başlangıçta objektif lens tarafından büyütülür. Elde edilen toplam büyütmenin her iki merceğin büyütmesinin bir ürünü olduğunu unutmayın.
Numune tipik olarak numunenin kendisi ve çevresi arasındaki kontrast farklılıkları nedeniyle görselleştirilir. Ancak bu, hücreler doğal olarak pigmentli olmadıkça, çevreleriyle çok az kontrasta sahip olan boyanmamış bakteriler için geçerli değildir. Bu nedenle boyama (aşağıdaki bölüme bakınız) mikroskopide çok önemli bir kavramdır. Aydınlık alan mikroskobu, daha büyük ökaryotik mikropları (yani protozoa, algler) boyasız görüntülemek için oldukça iyi çalışacaktır, ancak boyasız bakteriler neredeyse görünmez olacaktır. Boyanmış bakteriler aydınlık bir arka planda karanlık görünecektir (ah, "aydınlık alan" teriminin bir nedeni olduğunu biliyordum).
Karanlık Alan Mikroskobu
Karanlık alan mikroskobu aslında sadece biraz değiştirilmiş bir aydınlık alan mikroskobudur. Aslında bu modifikasyonu evinizdeki mikroskopta da yapabilirsiniz! Karanlık alan durdurucu olarak bilinen, ışığı doğrudan numunenin altında engelleyen opak bir disk kullanır, böylece ışık yanlardan ulaşır. Sonuç olarak, sadece numune tarafından yansıtılan veya kırılan ışık objektif merceği tarafından toplanır, bu da karanlık bir arka plana karşı parlak görünen hücrelerle sonuçlanır (bu nedenle "karanlık alan" terimi.) Evet, şimdi her şey mantıklı geliyor). Bu, hareketliliği veya ökaryotik organelleri gözlemlemek istiyorsanız özellikle güzel olan canlı, boyanmamış hücrelerin gözlemlenmesine izin verir.
Faz Kontrast Mikroskobu
Faz-kontrast mikroskobu da modifiye edilmiş bir aydınlık alan mikroskobudur, ancak modifikasyonlar daha karmaşık ve daha pahalı hale gelmektedir. Bu mikroskopta da opak bir halka veya dairesel durdurucu kullanılır, ancak bu mikroskopta ışığı yalnızca içi boş bir koni içinde serbest bırakan şeffaf bir halka vardır. Bu mikroskobun prensibi, kırılma indisine ve hücrelerin çevrelerinden farklı bir kırılma indisine sahip olmalarına dayanır, bu da hafifçe farklı bir fazda olan ışık üretir. Fark, özel bir faz objektifinde bulunan bir faz halkası tarafından yükseltilir. Faz farklılıkları parlaklık farklılıklarına dönüştürülebilir, bu da parlak bir arka planın ortasında karanlık bir görüntüye neden olur. Bu, canlı, boyasız hücrelerin gözlemlenmesine izin verir ve hareketlilik veya ökaryotik organel yapılarını gözlemlemek için yine kullanışlıdır.
Diferansiyel İnterferans Kontrast (DIC) Mikroskobu
Diferansiyel girişim kontrast mikroskobu, bir numunenin ve çevresinin kırılma indisindeki farklılıklardan yararlanarak faz-kontrast mikroskobu ile aynı prensipte çalışır. Ancak daha sonra bir prizma tarafından iki ışına bölünen polarize ışık kullanır. Bir ışık demeti numuneden geçerken, diğeri çevredeki alandan geçer. Işınlar ikinci bir prizma aracılığıyla birleştirildiğinde, faz dışı olmaları nedeniyle birbirleriyle "girişim" yaparlar. Ortaya çıkan görüntüler neredeyse 3 boyutlu bir etkiye sahiptir ve canlı, boyanmamış hücreleri gözlemlemek için kullanışlıdır.
Floresan Mikroskobu
Bir floresan mikroskobu, bir numunenin içinden geçmek yerine numuneden yayılan ışığı kullanır. Yoğun bir ışın demeti oluşturmak için cıva ark lambası kullanılır ve bu ışın demeti, kısa dalga boylarını yansıtan ve daha uzun dalga boylarını geçiren dikromatik bir ayna kullanılarak örneğe yönlendirilmesi için filtrelenir. Doğal olarak floresan olan organizmalar, kısa dalga boylarını emecek ve daha uzun bir dalga boyuna sahip floresan ışık yayacaklardır. Bu floresan ışık, dikromatik aynadan geçerek görselleştirilebilir. Doğal floresana sahip çeşitli mikroplar vardır, ancak bu nitelikten yoksun çok daha fazla organizma olduğu da kesindir. İkinci organizmaların görselleştirilmesi, belirli hücre bileşenlerine bağlanan floresan boyalar olan florokromların kullanımına bağlıdır. Florokromlar, hücrenin belirli yapılarını veya alanlarını ve hatta farklı organizmaları vurgulamak için antikorlara da eklenebilir.
Konfokal Taramalı Lazer Mikroskobu (CSLM)
Bir konfokal taramalı lazer mikroskobunun nasıl çalıştığını anlamak için bir floresan mikroskobunun nasıl çalıştığını anlamak faydalı olacaktır, bu nedenle umarım önceki bölümü zaten okumuşsunuzdur. Bir CSLM, yüksek yoğunluk nedeniyle aydınlatma için lazer kullanır. Işık, numuneyi "tarayarak" hareket eden dikromatik aynalara yönlendirilir. Floresanla boyanmış numune tarafından yayılan daha uzun dalga boyları, bir iğne deliğinden geçerek aynalardan geri geçer ve bir dedektör tarafından ölçülür. İğne deliği, lensin odak noktasını birleştirmeye yarar (ah, konfokal terimi buradan gelir!), yani belirli bir noktaya tam odaklanmayı sağlar. Numunenin tamamı x-z düzlemlerinde (her üç eksende) tarandığından, dedektör tarafından elde edilen bilgiler bir bilgisayar tarafından derlenerek tamamen odaklanmış tek bir 3D görüntü oluşturulabilir. Bu, biyofilmler gibi karmaşık yapıları görüntülemek için özellikle yararlı bir araçtır.
Boyama
Mikropların çoğu, özellikle de tek hücreli mikroplar, boyama yardımı olmadan belirgin olmayacaktır. Boyama mikroorganizma ile arka planı arasında kontrast sağlayarak bu kadar küçük bir şeyin görülmesini biraz daha kolaylaştırır. Basit bir boyama, ya hücreleri doğrudan boyamak (doğrudan boyama) ya da hücreleri çevreleyen arka planı boyamak (negatif boyama) için tek bir boya kullanır. Bu sayede bir araştırmacı bir hücrenin boyutu, morfolojisi (şekli) ve hücre düzeni hakkında temel bilgileri toplayabilir.
Diferansiyel boyalar olarak bilinen ve organizmaların özelliklerine göre ayırt edilmesini sağlamak için boyaları birleştiren daha karmaşık boyalar da vardır. 1884'te geliştirilen Gram boyası, mikrobiyolojide kullanılan en yaygın ayırıcı boyadır ve burada bakteri hücreleri hücre duvarı tiplerine göre ayrılır: mor renkte boyanan gram pozitif bakteriler ve pembe renkte boyanan gram negatif bakteriler. Bazı bakteriler, aside dirençli bakterilerin kırmızıya, aside dirençli olmayan bakterilerin ise maviye boyandığı aside dirençli boyayla boyanması gereken özel bir hücre duvarına sahiptir. Diğer diferansiyel boyalar, daha sonra bahsedilecek olan endosporlar, kapsüller ve flagella gibi spesifik bakteriyel yapıları hedef alır.
Daha da Modern Mikroskopi: Elektron Mikroskopları
Işık mikroskopları, ökaryotik mikropları gözlemliyorsanız harikadır ve bakteri ve arkeleri gözlemlemek için işe yarayabilirler, ancak virüsleri gözlemlemek için hiç işe yaramayacaklardır. Bir ışık mikroskobu için çözünürlük sınırının 0,2 μm veya 200 nm olduğunu ve çoğu virüsün bundan daha küçük olduğunu unutmayın. Bu yüzden daha güçlü bir şeye ihtiyacımız var. Görselleştirme için ışığı elektronlarla değiştiren elektron mikroskopları devreye giriyor. Elektronlar 1,23 nm (görünür ışığın 530 nm dalga boyunun aksine) dalga boyuna sahip olduğundan, çözünürlük 150.000x'in üzerinde büyütmelerle yaklaşık 0,5 nm'ye yükselir. Ayrıca, kapsamlı numune hazırlama işleminin numunenin özelliklerini bozabileceği veya artefaktların oluşmasına neden olabileceği konusunda bazı endişeler vardır.
İki farklı elektron mikroskobu türü vardır: transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM):
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)
Transmisyon elektron mikroskobu, elektromıknatıslar kullanılarak numuneye yönlendirilen bir elektron ışını kullanır. Yoğun alanlar elektronları dağıtarak görüntüde karanlık bir alan oluşmasına neden olurken, elektronlar daha az yoğun alanlardan geçerek (veya "transmit ederek") daha parlak bir bölüm oluşturur. Görüntü bir floresan ekran üzerinde oluşturulur ve daha sonra yakalanabilir.
Elektronlar aşırı kalın numuneler tarafından kolayca saçıldığından, numuneler tipik olarak bir tür plastik içine gömülerek ve ardından elmas bir bıçakla son derece ince kesitlere kesilerek 20-100 nm kalınlığa kadar dilimlenmelidir. Elde edilen resimler numunenin bir dilimini veya düzlemini temsil eder.
Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)
Taramalı elektron mikroskobu da bir elektron ışını kullanır, ancak görüntü numunenin yüzeyinden salınan ve daha sonra bir dedektör tarafından toplanan ikincil elektronlardan oluşur. Numunenin yükseltilmiş alanlarından daha fazla elektron salınırken, çökmüş alanlardan daha az ikincil elektron toplanacaktır. Buna ek olarak, elektron ışını numune yüzeyi üzerinde taranır ve dış özelliklerin 3 boyutlu bir görüntüsünü oluşturur.
Bazı güzel TEM ve SEM fotomikrograflarını görmek istiyorsanız, Dennis Kunkel'in sitesine göz atın. Çoğu renklendirilmiştir, ancak oldukça çarpıcıdırlar. Diğer uçta ise çocuklar için plastik bir mikroskop olan Intel Play QX3 ile çekilmiş fotoğraflar yer alıyor. Dikkatli olun, bu web sitesinde kaybolabilirsiniz. Ancak ne yaptığını bilen birinin elinde ucuz bir mikroskobun neler üretebileceğini görmek harika! Bu fotoğraflar da çok çarpıcı.
Yüzyıl Mikroskopisine Hoş Geldiniz: Taramalı Prob Mikroskopları
Teknoloji ilerledikçe, atomik düzeyde görselleştirmeye bile izin verebilen daha güçlü mikroskoplar icat edildi. Bu mikroskoplar mikrobiyolojide kullanılabilir, ancak daha çok 0,1 nm çözünürlük ve 100.000.000x büyütmeye ihtiyaç duyulabilecek her yerde kimyasalların, metallerin, manyetik örneklerin ve nanopartiküllerin görselleştirilmesine izin vermek için diğer alanlarda kullanılırlar.
Taramalı prob mikroskopları bu şekilde adlandırılmıştır çünkü bir tür probu x-z düzlemlerinde bir numunenin yüzeyi üzerinde hareket ettirerek bilgisayarların numunenin son derece ayrıntılı bir 3D görüntüsünü oluşturmasını sağlarlar. Çözünürlük bu kadar yüksektir çünkü prob boyutu görünür ışığın veya elektronların dalga boyundan çok daha küçüktür. Her iki mikroskop da sıvı içindeki nesneleri incelemek için kullanılabilir ve biyolojik moleküllerin incelenmesine olanak sağlar. Taramalı prob mikroskoplarının iki farklı türü vardır: taramalı tünelleme mikroskobu (STM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM):
Taramalı Tünelleme Mikroskobu (STM)
Taramalı tünel mikroskobu, örnek yüzeyi ile sürekli bir voltaj koruyan, 1 atom kalınlığında son derece keskin bir proba sahiptir ve elektronların aralarında seyahat etmesine izin verir. Bu tünelleme akımı, numunenin üzerinde sabit bir yükseklik sağlamak için probun yükseltilmesi ve alçaltılmasıyla korunur. Ortaya çıkan hareket, nihai görüntüyü oluşturan bir bilgisayar tarafından izlenir.
Atomic Force Microscope (AFM)
Atomik kuvvet mikroskobu, elektriği iyi iletmeyen numunelerde kullanılmak üzere STM'ye alternatif olarak geliştirilmiştir. Mikroskop, tipik olarak numune ile doğrudan temas ederek numunenin üzerinde sabit bir yükseklik sağlayan son derece keskin bir prob ucuna sahip bir konsol kullanır. Bu teması korumak için konsolun hareketi, bir lazer ışınını saptırarak nesnenin bir görüntüsüne dönüştürür. Bir kez daha, görüntüyü oluşturmak için bilgisayarlar kullanılır.
Yorumlar
Yorum Gönder